2-氯烟酸是一种重要的氮杂环类精细化工中间体，广泛应用于农药、医药化学品的合成。在农药领域，2-氯烟酸用于合成磺酰脲类除草剂烟嘧磺隆、酰胺类除草剂吡氟草胺、酰胺类杀菌剂啶酰菌胺等；在医药领域，2-氯烟酸可用于合成抗艾滋病药奈韦拉平、抗抑郁药米氮平、消炎药普拉洛芬、抗炎镇痛药尼氟灭酸等。目前工业上主要采用烟腈氧化-氯化-水解法合成2-氯烟酸，碱性条件下水解2-氯烟腈存在副产物高（5-10%的副产物2-氯烟酰胺）、酸碱用量大、能耗高等瓶颈。
腈转化酶（腈水合酶、腈水解酶和酰胺酶）是重要的工业酶催化剂。利用腈水合酶/酰胺酶双酶耦联合成2-氯烟酸具有过程简单、原子经济性高等优势。浙江工业大学郑裕国院士团队长期致力于腈转化酶生物催化基础研究和工程科技创新，开发了腈水合酶/酰胺酶双酶耦联合成2-氯烟酸新工艺。酰胺酶水解2-氯烟酰胺过程受吡啶环2-位氯取代引起的电子效应和空间位阻影响，催化效率低，成为工业合成2-氯烟酸的限速步骤。在本研究中，通过运用蛋白质底物/产物通道结构重塑策略，大幅提高了酰胺酶水解2-氯烟酰胺的催化效率，实现了2-氯烟酸的高效合成（图1）。
图1 酰胺酶的通道改造策略
研究首先利用RoseTTAFold预测了酰胺酶PaAmiM1的空间结构，发现其底物/产物出入酶活性中心的主通道存在一段由残基F130、A131、A152、F392、V402和L403组成的高度弯曲结构域。为了重塑该段通道结构，对以上关键氨基酸进行改造。此外，酰胺酶氧负离子洞通过影响四面体中间结构稳定性对其催化效率也具有重要影响。因此对PaAmiM1氧负离子洞周围关键氨基酸也进行了突变（图2）。
图2 PaAmiM1的通道及氧负离子洞结构解析
经过改造，最终获得了催化效率显著提高的三突变体PaAmiM1A378V+V402L+L403V。结合分子动力学模拟（MD）、量子力学计算（QM）和氢键网络分析，解析了突变体提高催化效率的分子机制，发现突变体的底物和产物在通道中的传送效率均显著提高（图3、图4）。此外，通道结构的改变使底物分子进入活性中心的构象发生转变，显著降低了2-位氯取代引起的空间位阻和亲核进攻反应能垒，同时活性中心的疏水环境减弱，更有利于水解反应的进行（图5、图6）。通过氢键网络分析，发现突变体与底物2-氯烟酰胺结合的氢键网络也得到了显著增强。
图3 底物（2-氯、4-氯、5-氯和6-氯烟酰胺）进入酶活性中心的结合能
图4 产物（2-氯、4-氯、5-氯和6-氯烟酸）释放至蛋白表面的解离能
图5 PaAmiM1A378V+V402L+L403V与不同氯代烟酰胺的反应结合构象
图6 野生型和突变体催化2-氯烟酰胺水解的亲核进攻反应能垒
最后，利用酰胺酶突变体全细胞催化2-氯烟酰胺水解合成2-氯烟酸，当细胞用量为2.5 g/L（干重）时，反应2 h产物的累积量达到1330 mM，时空产率达到2515 gproduct L?1 d?1，是目前报道的最高水平。
部分研究成果以“Structure-oriented Engineering of Amidase: Modification of Twisted Access Tunnel for Efficient Synthesis of 2-Chloronicotinic Acid”为题发表在《ACS Catalysis》。郑裕国院士团队副教授吴哲明为论文第一作者，郑仁朝教授为通讯作者。本研究得到国家自然科学基金（22008219, 22108251）以及国家重点研发计划政府间合作专项（2017YFE0129400）的支持。
论文信息：Zhe-Ming Wu, Feng Xie, Wen Zheng, Chang-Feng Liu, Chao-Ping Lin, Ren-Chao Zheng*, and Yu-Guo Zheng, “Structure-oriented Engineering of Amidase: Modification of Twisted Access Tunnel for Efficient Synthesis of 2-Chloronicotinic Acid”, ACS Catalysis, 2023, 13, 9078?9089.
论文链接：https://doi.org/10.1021/acscatal.3c01469