宝丹酮（BD），是一种非常重要的C17-羟基类固醇，它作为一种蛋白质合成代谢激素，在医学上常用于肌肉损伤和骨质疏松症。通过对C-19类甾体化合物1, 4-雄烯二酮（ADD）的C-17位点的还原能高效的获得宝丹酮，而ADD的成本较高，一直是困扰宝丹酮合成的阻碍。近年来，以新金分枝杆菌为主的微生物细胞工厂被开发能高效的将植物甾醇转化为ADD。因此，高效的细胞工厂急需被开发用于宝丹酮的高效合成。
浙江工业大学郑裕国院士团队通过细胞工厂的构建、酶工厂的应用，成功在新金分枝杆菌中强化了BD前体化合物ADD的产生和C-17位β还原酶活性的增强，完成了高产宝丹酮的细胞工厂构建。在此基础上通过优化多酶级联表达体系、生物转化体系等方式，进一步提高宝丹酮的产率，最终宝丹酮的产量进一步增加到5.56 g/L，时空产量达到1.39 g/(L?d)，为宝丹酮生物合成工业化的打下了良好的基础。
图1. 宝丹酮的合成示意图和关键酶17β-HSD的挖掘与筛选
研究团队首先从现有文献报道中筛选出8条潜在17β-HSD候选酶，对此进行同源性分析。筛选了四条来源不同的17β-HSD基因进行性能测试和筛选，在此基础上选择酶活表现较好的17β-HSDsc（Saccharomyces cerevisiae S288C，Gen Bank ID：NP_012142.3），并以此为起始序列，通过 NCBI 的 BLAST 程序寻找潜在的能转化甾体 C17 位的羰基为羟基的 17β-HSD。通过该方法筛选到来自B. naardenensis的17β-HSDbn表现出最高的相对活性并以此为模板开展17β-HSD的改造工作。
图2. 17β-HSD的活性位点分析、改造、机理解释
根据 SDR 的一般催化机理，预测构成了 17β-HSDbn 的催化核心，即 S141-Y154-K158 催化三联体模型。 继而根据该模型使用三种不同策略筛选突变位点，建立高效的突变文库。其一，运用 MOE 软件，将所有起相互作用的氨基酸残基进行虚拟定点饱和突变，并选择评分较高的结果进行定点突变。其二，运用HotSpot网站对突新金色分枝杆菌高效生产宝丹酮的细胞工厂构建突变位点进行预测，选择评分靠前的位点进行突变，并标注为蓝色字体。其三，根据Espript网站及weblogo网站的多序列比对结果，利用一致性序列设计的方法选择突变位点。综合上述三种方法，选择了 S93，S94，C95 等 23 个位点作为关键氨基酸残基。并通过对其中效果较好的N222W和G151V突变体进行机理分析。
图3. 17β-HSD在新金分枝杆菌的引入和多酶融合表达系统对宝丹酮产量影响的研究
研究人员发现，将17β-HSD导入至新金分枝杆菌后，17β-HSDbnN222W和17β-HSDbnG151Y突变体分别将宝丹酮产量提高至分别达到了2.64 g/L和2.88 g/L达到了43.48%和56.52%的摩尔转化率。进一步通过构建辅酶循环系统通共表达内源的g6pdh基因和外源的17β-hsdbnG151Y基因，使工程菌株的宝丹酮产量达到了3.26 g/L，比对照菌株高出13.19%。此外还将之前筛选到的ShKstDS161A敲入将至新金分枝杆菌基因组用于提升甾体1-2号位脱氢能力以消除副产物睾酮（TS）和雄烯二酮（AD）新金分枝杆菌基因组后，特别是MNΔkshA2::ShkstdS161A工程菌株，在144小时内宝丹酮产量达到了4.46 g/L，比对照菌株高出10.12%，同时显著减少了副产物雄酮（AD）和雄烯二酮（TS）的生成，分别降低了36.11%和19.36%。进一步，研究团队利用酶融合技术将不同的酶进行级联表达，形成一个底物传质更为高效的催化体系。通过使用甘氨酸-丝氨酸链接器将ShKstDS161A或G6PDH与17β-HSDbnG151Y融合并锚定到细胞膜上，以减少酶的运输并加速产品转化。实验结果表明，g6pdh与17β-HSDbnG151Y的双酶融合体系显著提高了宝丹酮的产量至5.11 g/L，比对照组提高了14.57%，摩尔转化率达到了73.99%。在此基础上研究团队进行对生物转化体系、底物转运体系进行进一步优化，最终宝丹酮产量达到了5.56 g/L，摩尔转化率为80.50%。
这项工作不仅展示了通过代谢工程和酶工程改造微生物以实现高效生物合成的可能性，还为未来的工业生产提供了可行的绿色替代方案。这一突破性成果不仅有助于满足市场对宝丹酮的需求，还为其他生物活性类固醇化合物的绿色生产提供了宝贵的经验和方法。
2024年11月17日，相关研究成果以“Construction of a Cell Factory for the Targeted and Efficient Production of Phytosterol to Boldenone in Mycobacterium neoaurum” 为题发表在《Biotechnology Journal》。
论文链接：
https://doi.org/10.1002/biot.202400489